（二）紫外光/可見(jiàn)光分光光度計(jì)
紫外光/可見(jiàn)光分光光度計(jì)基本裝置中采用高強(qiáng)度的鎢燈作為光源，能夠在可見(jiàn)光范圍（400~700nm）調(diào)節(jié)。氘燈用于紫外分光光度測(cè)量（200~400nm）；使用氘燈時(shí)要用石英杯，因?yàn)樽贤饩�不能透過(guò)玻璃。
分光光度計(jì)之所以優(yōu)于比色計(jì)就在于使用了一個(gè)衍射光柵將光源的復(fù)色光轉(zhuǎn)換為單色平行光束。實(shí)際上從這種單色一種產(chǎn)生的光不是某個(gè)波長(zhǎng)的光，而是一段窄的帶寬上的光，帶寬是分光光度計(jì)的一個(gè)重要特性，這是由于它決定了吸收測(cè)量中所用的波長(zhǎng)——普通分光光度計(jì)的帶寬為5~10nm，用于研究的儀器的帶寬小于1nm。
 因?yàn)楣鈻艎A縫的寬度影響著帶寬，帶寬隨光柵夾縫的寬度的減少而降低，要獲得特定波長(zhǎng)下的精確數(shù)據(jù)，盡可能使用最小的縫寬度。然而，減少了縫寬也會(huì)減少到達(dá)監(jiān)測(cè)器的光度，降低了信/噪比。縫寬可減少的程度取決于檢測(cè)/放大系統(tǒng)的靈敏度及穩(wěn)定性于離散光的存在。
大多數(shù)UV/可見(jiàn)光分光光度計(jì)使用的比色杯的光穿過(guò)路徑為10nm。一次性塑料杯適合于對(duì)水和乙醇溶液在可見(jiàn)光范圍內(nèi)的測(cè)量。玻璃比色杯的生產(chǎn)要求更加嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，因而在精確研究中要使用玻璃比色杯，尤其當(dāng)溶液的吸收值很低時(shí)（<0.1），即使盛對(duì)照液與待測(cè)樣品液的比色杯在光學(xué)性質(zhì)上有稍許不同，也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏差。玻璃和塑料會(huì)吸收UV光，因此在測(cè)波長(zhǎng)小于300nm的吸收值時(shí)要使用石英杯。
進(jìn)行測(cè)量之前，比色杯要保證干凈，無(wú)劃痕，外表面干燥，盛液到適當(dāng)高度，并放在了比色槽中的正確位置。生物樣品中蛋白質(zhì)和核酸可能會(huì)在玻璃/石英杯的內(nèi)表面沉積，因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯內(nèi)的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡過(guò)夜。腐蝕性及毒性溶液必須使用有蓋子的比色杯，以防止濺出，破壞儀器。
基本分光光度計(jì)使用的光電管類似于比色計(jì)中所使用的光電管。許多情況下，當(dāng)波長(zhǎng)高于和低于550~600nm時(shí)必須使用不同的光電管，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)诳梢?jiàn)光波長(zhǎng)內(nèi)的靈敏度不同，更精彩的儀器中所使用的是具有比光電管更高的靈敏度和穩(wěn)定性的檢測(cè)器。數(shù)字顯示由于不易產(chǎn)生視覺(jué)錯(cuò)誤和誤讀范圍的錯(cuò)誤，正逐漸代替指針讀數(shù)。一些儀器可以直接給出所測(cè)定物質(zhì)的濃度。
1．紫外光/可見(jiàn)光分光光度計(jì)的類型：
基本分光光度計(jì)只產(chǎn)生單束光。這種儀器首先用空白對(duì)照調(diào)到零吸收值，然后取出空白液，加入待測(cè)液，測(cè)定待測(cè)液的吸收值。也有一種雙束分光光度計(jì)，有單色光源產(chǎn)生的光束被分為兩束，一束穿過(guò)待測(cè)液，另一束穿過(guò)空白液。吸收值由一個(gè)電子線路通過(guò)對(duì)比透過(guò)待測(cè)液及空白液的出射光進(jìn)行測(cè)定。雙光束分光光度計(jì)減少了由于光源輸出的不穩(wěn)定或檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度的變化而導(dǎo)致的測(cè)量錯(cuò)誤，這時(shí)由于待測(cè)液與對(duì)照液是同時(shí)進(jìn)行測(cè)量的。記錄式分光光度計(jì)是一種雙束測(cè)定儀，用于記錄已知波段下吸收值隨時(shí)間的變化（如用于酶分析）。
2．分光光度計(jì)的定量分析：
假如已知一種物質(zhì)在某一波長(zhǎng)下的吸光率（通常是該物質(zhì)的最大吸收值，這時(shí)靈敏度最高），這種物質(zhì)純?nèi)芤旱臐舛瓤捎帽葼枺�朗伯關(guān)系式算出。摩爾吸光系數(shù)是指物質(zhì)在1mol/L的濃度下，比色杯厚度為1cm時(shí)的吸收值。該值可以從光譜數(shù)據(jù)表中查到，也可以用實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)測(cè)量一系列已知濃度的物質(zhì)的吸收值來(lái)繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣，在所要求的濃度范圍內(nèi)，便可確定吸收值與濃度之間存在的線性關(guān)系，該直線的斜率即為摩爾吸光系數(shù)。
比吸光率是指物質(zhì)質(zhì)量溶液濃度為10g/L時(shí)，比色杯厚度為1cm時(shí)測(cè)定的吸光值。該值對(duì)于未知分子質(zhì)量的物質(zhì)如蛋白質(zhì)核酸的測(cè)定很有用，這種情況下溶液中物質(zhì)的含量以其質(zhì)量表示而不用摩爾濃度表示。使用公式Log10(Io/I)=εl[C]時(shí)，比吸光率要除以10才可以得到一個(gè)以g/L為單位的濃度值。
這種簡(jiǎn)單的方法不能用于測(cè)定混合樣品。在這種情況下，也許可以通過(guò)測(cè)量幾個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度來(lái)估算每種成分的含量，如可用此方法在核酸存在下進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的估算。
分光光度計(jì)的使用方法：
（1）接通電源；（2）使用前預(yù)熱15min；（3）選擇波長(zhǎng)；（4）選擇檢測(cè)器；（5）如果可能的話，選擇正確的縫寬；（6）插入適當(dāng)?shù)目瞻讓?duì)照；（7）調(diào)解到0%的透過(guò)率；（8）將吸光值調(diào)到零；（9）分析樣品；（10）每測(cè)量10個(gè)樣品后，用空白對(duì)照校驗(yàn)零刻度；（11）檢測(cè)儀器的可重復(fù)性。
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