熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具。它是由
光源、濾板
系統(tǒng)和
光學系統(tǒng)等主要
部件組成。是利用一定
波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光,通過物鏡和
目鏡系統(tǒng)放大以觀察標本的熒光圖像。
v@,n]" AS1#_fC 1.光源
GgT 5'e;N 1`6kc9f. 現(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源,它是用石英玻璃制作,中間呈球形,內(nèi)充一定數(shù)量的汞,工作時由兩個電極間放電,引起水銀蒸發(fā),球內(nèi)氣壓迅速升高,當水銀完全蒸發(fā)時,可達50~70個
標準大氣壓力,這一過程一般約需5~15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強的紫外和藍紫光,足以激發(fā)各類熒光物質(zhì),因此,為熒光顯微鏡普遍采用。
tL#~U2K |)TI&T;k 超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此,燈室必須有良好的散熱條件,工作環(huán)境溫度不宜太高。
h2S!< qStZW^lFeY 新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃,使用一些時間后,則需要高壓啟動(約為15000V),啟動后,維持工作電壓一般為50~60V,工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命,在每次使用2h的情況下約為200h,開動一次工作時間愈短,則壽命愈短,如開一次只工作20min,則壽命降低50%。因此,使用時盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過程中,其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡后不可立即關(guān)閉,以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極,一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高,紫外線強烈,因此燈泡必須置燈室中方可點燃,以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時造成操作。
Fh8 8DDJ DsJ ikg(J 超高壓汞燈(100W或200W)光源的
電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動幾個部分。在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng),燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡,前面安裝有集光
透鏡。
g2RrBK, 國產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好,可以代替HBO-200等型的進口燈泡,平均壽命在200h以上,價格也比較低。
\_vjc]? ~Un+Zs%24 我國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置,體積小,重量輕,功率小,交、直流兩用(自帶直流電源),易于攜帶,使用方便,已推廣應(yīng)用。
7{z\^R^O @ra^0 2.濾色系統(tǒng)
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2([ 8'sT zB] 濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位,由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號,各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名,前面字母代表色調(diào),后面字母代表玻璃,數(shù)字代表型號特點。如德國產(chǎn)品(Schott)BG12,就是種藍色玻璃,B是藍色的第一個字母,G是玻璃的第一個字母;我國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示,如相當于BG12的藍色濾板名為QB24,Q是青色(藍色)拼音的第一個字母,B是玻璃拼音的第一個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名,如K530,就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數(shù)字命名,如美國Corning廠的NO:5-58,即相當于BG12。
kh4., \' yN@3uYBF 1).激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點,可選用以下三類激發(fā)濾板,提供一定波長范圍的激發(fā)光。
CJa`[;i0y H|\@[:A+ 紫外光激發(fā)濾板:此濾板可使400nm以下的紫外光透過,阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5,外加一塊BG-38,以除去紅色尾波。
<6.aSOS o}4~CN9} 紫外藍光激發(fā)濾板:此濾板可使300~450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3,外加BG-38。
k3PFCl~e !k3 eUBF 紫藍光激發(fā)濾板:它可使350~490nm的光通過。常用型號為QB24(BG12)。
s7d4)A% H^3f!\MC;o 最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達明色素)可用藍綠濾板(如B-7)激發(fā)。
42oW]b%P{; 0-P,zkK_v 近年開始采用金屬膜干涉濾板,由于針對性強,波長適當,因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達明的S546綠色濾板,均遠比玻璃濾板效果好。
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$dF4m 激發(fā)濾板分薄厚兩種,一般暗視野選用薄濾板,亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些;疽笫且垣@得最明亮的熒光和最好的背景為準。
bmzY^ %a @D[tljc^ 2).壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過,提供相應(yīng)濾長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應(yīng),常用以下3種壓制濾板:
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