光掃描共焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)是上世紀(jì)80年代開始投入實(shí)際應(yīng)用的一種顯微設(shè)備。與普通光學(xué)顯微鏡相比，LSCM具有更高的分辨率和放大倍率，并可以對(duì)觀測(cè)樣品進(jìn)行分層掃描，實(shí)現(xiàn)樣品的三維重建和測(cè)量分析; 與電子顯微鏡相比，LSCM可以在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值和膜電位等生理信號(hào)及活細(xì)胞形態(tài)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化。因此，這項(xiàng)產(chǎn)品的面世是顯微成像技術(shù)發(fā)展史中具有劃時(shí)代意義的重大進(jìn)展。LSCM在形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，以及材料學(xué)、地質(zhì)學(xué)、水利學(xué)等工業(yè)工程領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。根據(jù)應(yīng)用方向的不同，可分為生物用激光掃描共焦顯微鏡和工業(yè)用激光掃描共焦顯微鏡。
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I F$u 一.LSCM的基本原理及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
SCI1bMf ha5 bD% 普通光學(xué)顯微鏡使用的鹵素?zé)艄庠礊榛旌瞎猓庾V范圍寬，成像時(shí)樣品上每個(gè)照光點(diǎn)均會(huì)受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的干擾，影響成像質(zhì)量。而LSCM結(jié)構(gòu)上采用精密共焦空間濾波，形成物象共軛的獨(dú)特設(shè)計(jì)，激光經(jīng)物鏡焦平面上針孔形成點(diǎn)光源對(duì)樣品掃描，于測(cè)量透鏡焦平面的探測(cè)針孔處經(jīng)空間濾波后，有效地抑制同焦平面上非測(cè)量光點(diǎn)形成的雜散熒光和樣品不同焦平面發(fā)射來(lái)的干擾熒光。這是因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)物象共軛，只有物鏡焦平面上的點(diǎn)經(jīng)針孔空間濾波才能形成光點(diǎn)圖像，掃描后可得到信噪比極高的光學(xué)斷層圖像，分辨率比普通光學(xué)顯微鏡提高1.4倍。LSCM的光源為激光，單色性好，基本消色差，成像聚焦后焦深小，縱向分辨率高，可無(wú)損傷地對(duì)樣品作不同深度的層掃描和熒光強(qiáng)度測(cè)量，不同焦平面的光學(xué)切片經(jīng)三維重建后能得到樣品的三維立體結(jié)構(gòu)，這種功能被形象地稱為“顯微CT”。
FQQ@kP$. pB[%:w/@l: LSCM由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)成，整套儀器由計(jì)算機(jī)控制，各部件之間的操作切換都可在計(jì)算機(jī)操作平臺(tái)界面中方便靈活地進(jìn)行。顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在活細(xì)胞檢測(cè)等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用更廣泛。
7_1W:-A7W 4%%B0[Wo_O 二.LSCM的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用
0|GpZuGO9 #,)P N @P LSCM的高靈敏度、高分辨率、高放大倍數(shù)，提供了光學(xué)顯微鏡無(wú)法顯示的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞生物學(xué)研究上了一個(gè)臺(tái)階。目前我們可以在亞細(xì)胞水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞生物質(zhì)和離子通道的變化，觀察細(xì)胞在生理、病理和藥理情況下對(duì)外界因素作用所產(chǎn)生的快速反應(yīng)，進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位的分析測(cè)量。最常用的功能是細(xì)胞三維重建、細(xì)胞熒光檢測(cè)等。
V!H(;Tuuo 1. 細(xì)胞的三維重建
u8xk]:% 普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖像結(jié)構(gòu)為多層面的圖像疊加，結(jié)構(gòu)不夠清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿軸向?qū)?xì)胞進(jìn)行分層掃描，得到一組光學(xué)切片，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換后作為二維數(shù)組貯存。這些數(shù)組通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行不同的三維重建算法，可作單色或雙色圖像處理，組合成細(xì)胞真實(shí)的三維結(jié)構(gòu)。旋轉(zhuǎn)不同角度可觀察各側(cè)面的表面形態(tài)，也可從不同的斷面觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測(cè)量細(xì)胞的長(zhǎng)寬高、體積和斷層面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。通過(guò)模擬熒光處理算法，可以產(chǎn)生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體感。通過(guò)角度旋轉(zhuǎn)和細(xì)胞位置變化可產(chǎn)生三維動(dòng)畫效果。LSCM的三維重建廣泛用于各類細(xì)胞骨架和形態(tài)學(xué)分析、染色體分析、細(xì)胞程序化死亡的觀察、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)變化的分析和探測(cè)等方面。
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