新型光場顯微鏡高速記錄大腦神經(jīng)元活動和血流的快速動態(tài)變化
8月10日23點，Nature Biotechnology在線發(fā)表了由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類腦研究中心、神經(jīng)科學(xué)國家重點實驗室研究員王凱研究組完成的題為《共聚焦光場顯微鏡對小鼠和斑馬魚大腦快速體成像》的研究論文。該研究發(fā)展了一種新型體成像技術(shù)：共聚焦光場顯微鏡(Confocal light field microscopy)，可以對活體動物深部腦組織中神經(jīng)和血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行快速大范圍體成像�！ � N-3w)23*:
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跨腦區(qū)大規(guī)模的神經(jīng)元如何整合信息并影響行為是神經(jīng)科學(xué)中的核心問題，解答這一問題需要在更高時空分辨率上捕捉大量神經(jīng)元活動動態(tài)變化的工具。共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡等運用于活體腦成像的傳統(tǒng)工具基于點掃描，時間分辨率較低，難以研究大范圍腦區(qū)中神經(jīng)元的快速變化。因此，近年來科研人員一直致力于開發(fā)更快的成像方法。在多種新技術(shù)中，光場顯微鏡具有潛力，得到廣泛關(guān)注，其特點在于可以在相機(jī)的單次曝光瞬間，記錄來自物體不同深度的信號，通過反卷積算法重構(gòu)出整個三維體，實現(xiàn)快速體成像，在線蟲、斑馬魚幼魚等小型模式動物上已獲得初步應(yīng)用。 -DX|[70
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傳統(tǒng)光場顯微鏡存在兩個難以解決的問題，限制了其在生物成像上的應(yīng)用。首先，重構(gòu)的結(jié)果會出現(xiàn)失真。2017年，王凱研究組研發(fā)的新型擴(kuò)增視場光場顯微鏡（eXtended field-of-view Light Field Microscopy, XLFM）解決了這一問題，并應(yīng)用于自由行為斑馬魚幼魚的全腦神經(jīng)元功能成像上，首次三維記錄了斑馬魚幼魚在完整捕食行為中的全腦神經(jīng)元活動的變化。其次，現(xiàn)有光場顯微成像技術(shù)缺乏光學(xué)切片能力，無法對較厚組織，如小鼠的大腦進(jìn)行成像。讓光場顯微鏡具有共聚焦顯微鏡一樣的光學(xué)切片能力，濾除大樣品中焦層之外的背景信號來提高信噪比，是提高成像質(zhì)量、可廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在。 2 'xT%
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然而，傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡采用激光逐點掃描和共軛點針孔檢測來降低焦面外噪聲的策略不適用于三維光場顯微鏡。面對這一挑戰(zhàn)，研究團(tuán)隊創(chuàng)新提出廣義共聚焦檢測的概念，使其可以與光場顯微鏡的三維成像策略結(jié)合，在不犧牲體成像速度的前提下有效濾除背景噪聲，提高了靈敏度和分辨率。這種新型的光場顯微成像技術(shù)稱為共聚焦光場顯微鏡。 `iv,aQ '
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研究團(tuán)隊在不同動物樣品上測試了共聚焦光場顯微鏡的成像能力。團(tuán)隊成員對包埋的活體斑馬魚幼魚進(jìn)行全腦鈣成像，對比共聚焦和傳統(tǒng)光場顯微鏡的成像結(jié)果，發(fā)現(xiàn)加入光學(xué)切片能力后，圖像分辨率和信號噪聲比提高，可以檢測到更多較弱的鈣活動。進(jìn)一步的，將共聚焦光場顯微鏡和高速三維追蹤系統(tǒng)結(jié)合，對自由行為的斑馬魚幼魚進(jìn)行全腦鈣成像，在ø 800 μm x 200 μm的體積內(nèi)達(dá)到2 x 2 x 2.5 μm3的空間分辨率和6Hz的時間分辨率。受益于更高的分辨率和靈敏度，可以識別出斑馬魚幼魚在捕食草履蟲過程中單個神經(jīng)元的鈣離子活動的變化。 @]WN|K
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團(tuán)隊成員驗證了共聚焦光場顯微鏡對小鼠大腦的成像效果，對清醒小鼠的視皮層進(jìn)行鈣成像，可以同時記錄ø 800 μm x 150 μm的體積內(nèi)近千個神經(jīng)元的活動，最深可達(dá)約400 μm，且連續(xù)5小時以上穩(wěn)定記錄超過10萬幀，沒有明顯的光漂白。團(tuán)隊成員進(jìn)一步嘗試使用共聚焦光場顯微鏡對鼠腦中的血細(xì)胞進(jìn)行成像，深度可達(dá)600 μm，拍攝速度70 Hz，同時記錄上千根血管分支中群體血細(xì)胞的流動情況并計算血細(xì)胞的速度，相比之前的傳統(tǒng)成像方法通量提高了百余倍。 ~?E x?!\9R
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研究團(tuán)隊在自由行為的斑馬魚幼魚和小鼠大腦上證明了共聚焦光場顯微鏡有更高的分辨率和靈敏度，為研究大范圍神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和血管網(wǎng)絡(luò)的功能提供了新的工具。同時，該技術(shù)不僅適用腦組織的成像，還可以根據(jù)所需成像的樣品種類靈活調(diào)整分辨率、成像范圍和速度，應(yīng)用在其他厚組織的快速動態(tài)成像中。 0Vh|UJ'&7
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研究在王凱的指導(dǎo)下，主要由博士研究生張朕坤、白璐，以及助理研究員叢林共同完成。王凱研究組余鵬、張?zhí)锢�，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)本科生石萬卓，杜久林研究組李福寧做出貢獻(xiàn)，研究員杜久林參與合作并給予指導(dǎo)意見。研究得到中科院腦智卓越中心實驗動物平臺的支持。研究工作受到科技部、中科院、國家自然科學(xué)基金委員會和上海市的資助。 s=~r. x
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圖1.（上）共聚焦光場顯微鏡原理示意圖。（下）不同于傳統(tǒng)光場顯微鏡，共聚焦光場顯微鏡采用片狀照明，選擇性激發(fā)樣本的一部分，在垂直照明的方向上掃描，采集到的信號被遮擋板過濾掉焦層范圍之外的部分。對采集到的圖像進(jìn)行重構(gòu)可以得到焦層內(nèi)的三維信息。 xlqRW"
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圖2.（左）斑馬魚幼魚捕食行為的一個例子。0s 為斑馬魚吞食草履蟲的時刻。（右）左圖斑馬魚捕食行為中，共聚焦光場顯微鏡記錄到的兩個不同腦區(qū)的神經(jīng)元活動。箭頭所指為過程中激活的單個神經(jīng)元。 uV52ko,
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圖3.（左）共聚焦光場顯微鏡拍攝得到的小鼠視皮層中的復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)。6個在不同深度拍攝的體積連接為一個深度達(dá)600 μm的三維結(jié)構(gòu)。（中）100 μm到250 μm深度血管網(wǎng)絡(luò)的平面投影，顏色代表不同血管分支中血細(xì)胞的平均流速。（右）圖中箭頭所指的區(qū)域中五個血管分支在一段時間內(nèi)流過血細(xì)胞數(shù)量的計數(shù)。
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