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2022-05-25 09:01 |
華南師范大學(xué)在非線性熒光損耗機(jī)理及超分辨熒光顯微成像領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展
近日，華南師范大學(xué)華南先進(jìn)光電子研究院光及電磁波研究中心詹求強(qiáng)教授課題組在非線性熒光損耗機(jī)理及超分辨熒光顯微成像領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展：在熒光損耗物理機(jī)理上，提出了受激輻射誘導(dǎo)激發(fā)損耗新機(jī)理，“拔本塞源”式對敏化能級進(jìn)行損耗，從源頭阻斷熒光的激發(fā)能量，新機(jī)理帶來的“熒光損耗放大效應(yīng)”大幅降低了超分辨所需要的激光光強(qiáng)，在低光強(qiáng)條件下實現(xiàn)了9種不同光譜探針的熒光損耗。在超分辨成像技術(shù)上，由此發(fā)展了一種通用性強(qiáng)的基于單對低光強(qiáng)、近紅外、連續(xù)波激光的多色超分辨顯微成像技術(shù)，克服了傳統(tǒng)多色STED超分辨系統(tǒng)所依賴的多對超快脈沖光束協(xié)同工作的復(fù)雜系統(tǒng)、高成本、低穩(wěn)定性等問題。該成果于北京時間5月23日以“Achieving low-power single-wavelength-pair nanoscopy with NIR-II continuous-wave laser for multi-chromatic probes”為題在Nature子刊《Nature Communications》在線發(fā)表。 >d{O1by=d9
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受激發(fā)射損耗（Stimulated emission depletion, STED）超分辨顯微鏡的概念由德國科學(xué)家Stefan W. Hell于1994年提出，該技術(shù)于2014年獲得了諾貝爾獎。STED超分辨技術(shù)的原理是在激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，額外引入一束空心環(huán)形激光光束，通過受激發(fā)射損耗熒光探針的激發(fā)態(tài)電子，將激發(fā)光斑外圍的熒光信號損耗掉，從而壓縮有效熒光點擴(kuò)散函數(shù)，突破衍射極限提高分辨率。與其他超分辨成像技術(shù)相比，STED具有光學(xué)切片、無需計算重構(gòu)、可實時成像等優(yōu)點，是一種純物理法的超分辨熒光成像技術(shù)。然而，傳統(tǒng)STED顯微鏡存在原理性局限和問題：受激輻射作用如果要在與自發(fā)輻射（壽命有機(jī)染料通常為納秒級）競爭中占主導(dǎo)，通常需要高功率的超短脈沖（飛秒/皮秒）激光作為損耗激光，這往往會導(dǎo)致嚴(yán)重的光漂白、光毒性和重激發(fā)背景等問題。此外，激發(fā)/損耗光的波段需要根據(jù)不同熒光探針的光譜特性進(jìn)行選擇，為了匹配多色探針的應(yīng)用和多色超分辨成像的需求，每更換（增加）一種不同顏色的探針STED系統(tǒng)就要更換（增加）一對激光器的波長，超分辨成像需要對多對激光進(jìn)行高精度三維空間xyz重合（納米級）、精準(zhǔn)的脈沖時延同步控制（納秒級），這會導(dǎo)致超分辨技術(shù)和系統(tǒng)復(fù)雜度高、成本高、維護(hù)難。此外，這種情況下熒光探針之間的光譜重疊也會導(dǎo)致熒光檢測通道之間的信號串?dāng)_。針對上述關(guān)鍵問題和重要需求，詹求強(qiáng)教授自2017年起帶領(lǐng)研究生探索新機(jī)理，最終以STED原理性缺陷為突破口，提出全新機(jī)理解決了關(guān)鍵問題。 VHUOI64*
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上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒是一種納米熒光探針，具有近紅外激發(fā)、反斯托克斯位移大、無背景熒光、發(fā)光極其穩(wěn)定等獨特優(yōu)勢。上轉(zhuǎn)換納米探針通常是一個敏化-發(fā)光二元系統(tǒng)，敏化離子負(fù)責(zé)吸收激發(fā)光能量，然后傳遞給發(fā)光離子輻射波長更短的熒光。為解決STED面臨的上述難題，詹求強(qiáng)課題組基于上轉(zhuǎn)換熒光技術(shù)提出了全新的思路：抑制敏化離子和發(fā)光離子間的能量傳遞過程就可以切斷對發(fā)光離子的能量補給，讓發(fā)光離子“無光可發(fā)”，即受激輻射誘導(dǎo)激發(fā)損耗機(jī)理（Stimulated-emission induced excitation depletion, STExD）。結(jié)合上轉(zhuǎn)換發(fā)光的多光子非線性泵浦依賴特性（非線性效應(yīng)隨泵浦的光子數(shù)增多而不斷增強(qiáng)），實現(xiàn)了光子數(shù)越高的熒光能級電子損耗越強(qiáng)烈，STExD機(jī)理具有傳統(tǒng)STED所不具有的對熒光損耗進(jìn)行非線性放大的獨特效應(yīng)，與之伴隨的技術(shù)意義就是可以逐級降低高能級熒光損耗所需要的飽和光強(qiáng)，這突破了傳統(tǒng)STED中的飽和光強(qiáng)理論的限制（實驗值明顯低于傳統(tǒng)理論值）�；诖耍芯繄F(tuán)隊使用740 nm的激發(fā)光和1064 nm的損耗光，在釹摻雜的上轉(zhuǎn)換熒光探針中實現(xiàn)了高達(dá)99.3%的超高損耗效率，損耗飽和光強(qiáng)降低至23.8 kW/cm2，比傳統(tǒng)STED探針降低了3個數(shù)量級。結(jié)合上轉(zhuǎn)換發(fā)光一對多的敏化-發(fā)光特性，STExD可以實現(xiàn)一對激光實現(xiàn)對多種UCNPs探針的光開關(guān)控制。釹離子是上轉(zhuǎn)換發(fā)光常用的敏化離子，可以單獨或與鐿離子聯(lián)合敏化多種發(fā)光離子，研究團(tuán)隊利用鐿離子的能量傳遞橋梁作用，僅使用一組固定波長的激光器就成功實現(xiàn)了鉺離子，鈥離子的高效熒光損耗，損耗效率分別超過90%和80%。進(jìn)一步地，也分別在鐠、銪、銩、鋱摻雜的體系中實現(xiàn)了高效的熒光損耗效應(yīng)，總計實現(xiàn)9種不同光譜探針的同時熒光損耗。 JuD$CHg;#
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以此新機(jī)理STExD為基礎(chǔ)，課題組發(fā)展了一種基于單對低光強(qiáng)、近紅外、連續(xù)波激光的多色超分辨顯微成像技術(shù)，分別對釹（黃色），鉺（紅色），鈥（綠色）摻雜的上轉(zhuǎn)換熒光探針實現(xiàn)了不同顏色的超分辨成像，原始圖像分辨率達(dá)34 nm，并進(jìn)一步實現(xiàn)了釹、鈥摻雜的上轉(zhuǎn)換熒光雙色超分辨成像。通過熒光探針的表面改性和特異性修飾，課題組成功將上轉(zhuǎn)換熒光探針免疫標(biāo)記到HeLa癌細(xì)胞的肌動蛋白纖維，實現(xiàn)了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的超分辨生物成像。該工作提出的STExD通用發(fā)光損耗策略巧妙地利用了上轉(zhuǎn)換熒光的傳能發(fā)光特性，為解決傳統(tǒng)STED技術(shù)的問題、開發(fā)新型探針提供了新的方案，為開發(fā)低光毒性、深層組織（近紅外II區(qū)損耗激光）的多色超分辨成像技術(shù)奠定了基礎(chǔ)，在突破衍射極限的光傳感、光遺傳學(xué)、光刻等前沿領(lǐng)域也具有廣泛的應(yīng)用前景。 HxgH* IMs
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我校2017級碩士研究生郭鑫、蒲銳（現(xiàn)均為博士研究生）為論文的共同第一作者，課題組2016級黃冰如、2015級吳秋生等碩士生對該課題的實驗做出了重要貢獻(xiàn)，詹求強(qiáng)教授為論文的獨立通訊作者，華南師范大學(xué)為第一署名單位。參與工作的還有課題組其他研究生，同時來自瑞典皇家理工學(xué)院（KTH）Jerker Widengren教授、劉海春博士等長期合作者對課題進(jìn)行了重要討論和指導(dǎo)。 ~H0WHqcy
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該研究得到了國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金項目、廣東省杰出青年科學(xué)基金、國家自然科學(xué)基金面上項目等經(jīng)費的支持。 0aF&5Lk`y
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