摘 要 激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來(lái)的醫(yī)學(xué)圖象分析儀器，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于熒光定量測(cè)量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細(xì)胞動(dòng)力學(xué)參數(shù)監(jiān)測(cè)和胞間通訊研究等方面。其性能為普遍光學(xué)顯微鏡質(zhì)的飛躍，是電子顯微鏡的一個(gè)補(bǔ)充。本文以美國(guó)Meridian公司的ACAS ULTIMA312為例簡(jiǎn)要介紹了激光掃描共聚顯微鏡系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，功能和生物學(xué)應(yīng)用前景。 關(guān)鍵詞 激光；共聚焦顯微鏡；粘附細(xì)胞分析與篩選（ACAS） i2bkgyzB.  
The Laser Scanning Confocal Microscopy System and its Biological Applications 2bIP.M2Fs  
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Chen Yaowen ,Lin Jielong ,Lai Xiaoying ,Mei Pinchao PB[Y^q
 
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(Shantou Uni.Med .College,Central Lab ,Shantou Guangdong 515031) |
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Ahstract The Laser Scanning Confocal Microscopy is a new medical image analysis instrument ,which is developed in the last decade.Now it is widely applied in such fields as fluorescent quantitative measurement ,conpocal image andlyusis ,3-D reconstruction ,Kinetic signal monitioring of living cell ,cellcell communication researches ,etc .In this paper ,ACSA ULTIMA 312(Meridian Co,USA)is taken as an example to introduce the principle of confocal microscopy ,its funetions and biological applications. {Xr|L  
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Key words Laser Confocal Microscopy Adherent Cell Analysis and sorting(ACSA) 2TQyQ%  
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激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning Confocal Microscopy ，簡(jiǎn)稱LSCM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化。已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域[1、2、3]，對(duì)生物樣品進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領(lǐng)域新一代強(qiáng)有力的研究工具。 0c{-$K}  
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創(chuàng)建于1983年的美國(guó)Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項(xiàng)具有劃時(shí)代的義意的高科技產(chǎn)品，曾獲得美國(guó)“政府新產(chǎn)品獎(jiǎng)”和兩次“高科技領(lǐng)先技術(shù)獎(jiǎng)”，它能達(dá)到每秒120幅畫(huà)面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實(shí)時(shí)，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACAS uLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產(chǎn)品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器�，F(xiàn)以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用。 +K2p2Dw(k  
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1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成 `1xJ1z#  
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有關(guān)共聚焦顯微鏡的某些技術(shù)原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡[5]，1985年Wijnaendts Van Resandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。 6h5DvSO  
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激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)擴(kuò)束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長(zhǎng)通分色反射鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個(gè)方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過(guò)物鏡、長(zhǎng)通分色反射鏡、聚焦透鏡、會(huì)聚在聚焦物鏡的焦點(diǎn)處，再通過(guò)焦點(diǎn)處的針孔，由檢測(cè)器接收。 9nGS"E l{  
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從圖1中可以看出，只有在物鏡的焦平面上發(fā)出的熒光才夠到達(dá)檢測(cè)器，其它位置發(fā)出的光均不能過(guò)針孔。由于物鏡和會(huì)聚透鏡的焦點(diǎn)在同一光軸上，因而稱這種方式成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像過(guò)程中針孔起著關(guān)鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍學(xué)顯微鏡掃描方式成像，而且對(duì)圖像的對(duì)比度和分辨率有重要的影響。 77zfRSb+  
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ACAS ULTIMa 312采用快速鏡掃描或臺(tái)階掃描對(duì)樣品逐點(diǎn)掃描成像，由于樣品中不同的掃描點(diǎn)始終在物鏡和會(huì)聚透鏡的光軸上，因而它以相同的信噪比掃描整個(gè)樣品，掃描精度達(dá)0.1μm，掃描面積最大的為10cm×8cm，當(dāng)激光逐點(diǎn)掃描樣品時(shí)，針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，并將之轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚聚焦圖像。一個(gè)微動(dòng)步進(jìn)馬達(dá)控制栽物臺(tái)的升降，使焦平面依次位于標(biāo)本的不同層面上，可以逐層獲得標(biāo)本相應(yīng)的光學(xué)橫斷面的圖像。這稱為“光學(xué)切片”。再利用計(jì)算機(jī)的圖像處理及三維重建軟件。可以得到高清晰度來(lái)表現(xiàn)標(biāo)本的外形剖面，十分靈活、直觀地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。 6'S